SCI？3分以上？只測轉錄組？

      都說現在轉錄組測序已經成為實驗室常規分析內容，經過了近十年的應用，不可否認，轉錄組測序確實也變成了常規手段，這也導致了現在純粹的轉錄組文章越發難發表。但是轉錄組的分析是不是就越來越不受重視了呢？其實不然，對轉錄組的數據進行深度的挖掘與分析，也會有新穎的內容被發現，也會受到雜志主編的重視。今天就以武漢愛基百客2019年發表在Plant Physiol Biochem（IF=3.404）的文章Comparative transcriptome analysis of Rosa chinensis 'Slater's crimson China' provides insights into the crucial factors and signaling pathways in heat stress response.為例，來看一下如何“玩轉”轉錄組分析。

一、研究背景與材料

1、研究對象：月季

2、研究背景：

      月季是重要的栽培花卉，其生長和開花的Z佳溫度為22-26℃。月季的生長發育過程中，往往受高溫的逆境脅迫。在擬南芥等植物中熱激響應機制已經被廣泛探究，熱激轉錄因子家族、熱激響應基因、ABA植物激素等已被廣泛證明參與了植物的高溫逆境脅迫響應。因此對于非模式植物而言，分析熱激關鍵響應基因，闡述熱激響應機制具有十分重要的作用。 

3、實驗材料

      健康、大小一致、高度一致的月季扦插苗常規條件下生長40天后，42℃高溫處理0h（對照），0.5h，2h，6h，12h，18h和24h，每個處理設置三個生物學重復。選取處理0、0.5、2、6、12小時的月季材料用于RNA-seq的建庫測序，同時選取0、2、6、12、18、24小時的葉片用于生理生化指標檢測。

二：結果

1、常規分析一個不少

      對于轉錄組分析而言，一些常規分析內容是必不可少的，包括測序結果的評估、轉錄本的拼接等等。不同高溫下的差異基因的挖掘也是探究響應熱激反應的基礎，因此對于差異基因的挖掘以及注釋也是分析相應的重點。

2、重要基因重點關注

      針對轉錄組分析結果，結合研究背景與需求，對其中的重要基因的基因挖掘和表達模式探究是轉錄組分析挖掘重要基因的手段。作者對不同處理下的信號轉導相關基因、HSPs、轉錄因子、氧化還原相關基因、光合作用相關基因、碳水化合物相關基因、激素相關基因進行了重點關注，并對重要的基因進行了表達模式的探究以及驗證。

3、深度分析錦上添花

      對于一般的轉錄組文章，上述兩個分析內容完成后文章已經達到完成的標準，但是如果獲得一個高分雜志的青睞肯定是不可能的，還需要對現有結果，進行數據的深度挖掘。本文作者就是對現有結果進行了后續的共表達網絡（WGCNA）分析。共表達網絡的分析是轉錄組分析中較為重要的分析內容，它通過基因表達量將表達具有一致性的基因模塊化，并對模塊內的基因進行進一步的分析。作者將所有基因分為21個模塊，并對其中基因高表達發生于早期、中期、晚期的不同模塊進行了展示。

      轉錄因子調控靶基因的表達從而實現不同的生物功能一直是闡述生命機制的重要研究內容，因此作者希望對轉錄組WGCNA數據進一步挖掘，意圖闡述相應的調控模式。作者對于重點關注的早期高表達基因和晚期高表達基因的兩個模塊進行了轉錄因子和靶基因的預測與調控網絡分析。通過對模塊內基因的啟動子區序列進行調取，結合自己構建的轉錄因子的motif數據庫，預測調控模塊內重要基因的轉錄因子（即下圖紅圈標注基因），并對調控的下游靶基因進行了GO的注釋。通過以上分析，作者構建了重要轉錄因子（紅色圓圈標注）--保守motif序列（綠色三角標注）--重要下游基因（藍色八邊形標注）的調控網絡模式，為進一步闡述月季響應熱激脅迫的機制提供了基礎。

4、驗證討論，完美收官

      轉錄組分析中重要基因的RT-qPCR驗證必不可少，作者挑選了18個關鍵基因進行了驗證。并針對上述分析結果，對月季熱激脅迫下的響應過程進行了總結，并且構建了葉片響應熱激脅迫的模型。

總  結：

      其實不單單是轉錄組測序，面對諸多測序的結果，如果沒有一個思路，往往會覺得無從下手。該文章除了對常規的差異基因的一些鑒定以及GO和KEGG分析之外，立足于本實驗的熱激脅迫，探究在其中發揮重要作用的轉錄因子、Ca2+、植物激素等進行基因的進一步挖掘。通過共表達網絡分析，探究具有特色的模塊，對特色模塊進行進一步分析，并創新性的通過對模塊內基因的啟動子序列與已有的轉錄因子數據庫聯合分析，構建了重要轉錄因子調控關鍵基因的網絡。Z終總結分析轉錄組結果，構建月季響應熱激脅迫的相關機制。

      本實驗從文庫的構建、測序、基因的拼接、以及后續的一系列分析都是由武漢愛基百客完成，本文的第一作者李澤卿作為公司的總經理結合本次實驗的需求，不斷完善公司轉錄組分析的流程與內容，不僅為本篇文章也為后續客戶對于轉錄組的分析打下來基礎。