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ChIP質控之染色質片段化

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ChIP質控之染色質片段化

發布日期:2021-04-20 作者:程偉 點擊:

Chromatin
染色質片段化

前面我們給大家講解了ChIP質控之WB詳解,有沒看過的老師可以點擊鏈接https://mp.weixin.qq.com/s/O9DZbWmv2Pqm53hiVgPxWA進行查看。

今天我們來說說ChIP質控之染色質片段化那些事吧。

樣品經過甲醛交聯后,DNA與蛋白質互作的過程已經在生物體內被固定,之后ChIP中染色質片段化后,針對目的蛋白的特殊抗體富集該目的蛋白,從而該蛋白互作的DNA也被pull下來,之后通過常規的DNA建庫后,生信分析手段能夠得到這些DNA的信息,這些DNA中某些區域大量富集就會產生peak峰,peak峰對應的基因即為與目的蛋白互作的DNA。

從上面的實驗步驟來看,片段化的好壞會直接影響后面分析的結果,片段化的片段過大,一來目前常用的測序平臺PE150用得Z多,過大的片段不容易得到全長序列,后續基因在基因組上的定位信息有小概率的出錯。另外,過大的片段會有多個結合位點,很有可能產生假陽性富集。那么片段過小行不行呢?片段過小不是能更精確的得到富集區域么?當然了,理論上是這樣,但是我們得根據實際情況來。首先,片段過小,可能會有部分結合位點被打斷,使得該區域不能富集;另外,片段過小,在DNA純化及建庫過程中,磁珠或者純化柱會優先結合大片段,有些小片段可能會被丟失;Z后,在測序的過程中,小片段會有優先測序,而目前我們使用的測序平臺因為測序量的問題,會同時鋪多個文庫,某個文庫小片段居多,會影響整體的測序質量,而且PE150測序平臺,片段過小,也會造成測序的浪費??偟膩碚f,染色質片段化結果不能過大也不能過小。

那么染色質片段化到多大才Z合適呢?我們認為,如果是Z終是做ChIP-seq的話,染色質片段化大小集中在100-500 bp,如果是做的ChIP-qPCR的話,染色質片段化的片段Z好集中在100-1000 bp。大家可以考慮下,為什么呢?

染色質片段化的方法通常有超聲和酶解兩種方法,兩種方法得到的片段分布圖不太一樣,一個是得到一個拖帶圖,一個是有很明顯的核小體條帶分布。



圖片1.png

超聲片段化

圖片2.png

酶解片段化

目前市場上超聲的儀器多種多樣,儀器功率也殘差不齊,就連同一個公司的儀器還有不同的型號,所以我們不能一概而論說超聲次數以及參數如何設置,只能說大家在正式實驗前,針對不同的儀器,不同的樣本得先摸索出不同的超聲條件。

那么用酶解的方式是不是就不需要超聲呢?也不是的,酶解方法主要利用微球菌核酸酶特異性切割核小體連接的DNA區域,所以Z終會有不同大小的核小體分布圖,但是酶解之后,我們還是需要對樣本進行1-2個循環的超聲來釋放片段化后的染色質。

這里,我不得不小小得意一番,愛基百客公司目前已經成功實驗了5000+ChIP結果,試驗的樣本種類也是超過了200+,抗體種類也是至少有100+了,樣本小到不同的細菌、真菌樣本,達到各種林木材料;常規的組織、細胞樣本太多太多,不常規難做的果實、果肉組織、含高糖、高淀粉、高脂肪樣本也都能成功實驗,疑難樣本的處理也因此申請了不少方法學專利。不同的樣本針對我們公司的儀器也已經有了成熟的超聲體系。

下面給大家展示下一些染色質片段化的圖吧,這些圖里有好的有壞的,經過了上面的講解后,大家能夠分辨哪些結果好,哪些結果壞么?歡迎各位老師在留言處答題啊O(∩_∩)O

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本文網址:http://www.oyuncash.com/news/580.html

關鍵詞:ChIP,ChIP-seq,ChIP-qPCR

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