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【客戶文章】RIP/CLIP技術助陣研究胰腺癌中CLK1/SRSF5誘導的METL14和Cyclin L2外顯子跳躍

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【客戶文章】RIP/CLIP技術助陣研究胰腺癌中CLK1/SRSF5誘導的METL14和Cyclin L2外顯子跳躍

發布日期:2021-04-23 作者:程偉 點擊:

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雜志:Journal of Hematology & Oncology

doi: 10.1186/s13045-021-01072-8,IF=11.059


CLK1/SRSF5通路誘導METL14Cyclin L2的異常外顯子跳躍,促使胰腺癌生長和轉移

CLK1/SRSF5 pathway induces aberrant exon skipping of METTL14 and Cyclin L2 and promotes growth and metastasis of pancreatic cancer


研究材料

臨床胰腺癌及其癌旁正常組織、PANC-1和BxPC-3細胞

研究技術

RNA-seq、RIP-qPCR、CLIP-qPCR、磷酸化蛋白組、RNA pull down、 Co-IP等

文章思路

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研究背景

異常選擇性剪接和m6A甲基化在胰腺癌(PC)的發生發展中都發揮著復雜的作用,但這兩種RNA修飾之間的關系尚不清楚。

研究結果

在PDAC組織中,CLK1的mRNA和蛋白水平均顯著升高。CLK1高表達與不良預后相關。體外和體內實驗表明,CLK1表達升高可促進PC細胞的生長和轉移。從機制上講,CLK1增強了SRSF5上的磷酸化,抑制了METTL14 exon10的跳變,同時促進了Cyclin L2exon6.3的跳躍。此外,異常的METTL14 exon10跳躍增強了N6 -甲基腺苷修飾水平和轉移,而異常的Cyclin L2exon6.3促進了PDAC細胞的增殖。CLK1/SRSF5通路誘導METTL14和Cyclin L2的異常外顯子跳躍,從而促進PDAC細胞的生長和轉移,并調控m6A甲基化。本研究表明該通路在PDAC患者中具有潛在的預后價值和治療靶向性。

1、胰腺癌組織中CLK1表達升高與PDAC患者預后惡化相關

15對胰腺癌及其癌旁正常組織樣本的RNA-seq分析發現CLK1為鑒定出的唯一的一個與選擇性剪接相關的過表達基因。從公共數據庫GEO和TCGA數據庫中發現CLK1在大多數胰腺癌組織中比正常組織表達量高。檢測不同細胞中CLK1的基因表達情況及蛋白表達情況,并且IHC檢測病例樣本中針對CLK1的情況,結果表明預后較差的病人中CLK1的表達量增高。CLK1敲除或者過表達的細胞中進行細胞生長狀態觀察、以及細胞遷移和侵襲實驗,并且在裸鼠中進行肺解剖觀察及遷移實驗,確定CLK1的表達促進胰腺癌細胞在體內及體外的轉移能力。

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圖:CLK1在人胰腺癌中的表達情況及臨床預后價值

2、  CLK1廣泛調控可變剪接相關蛋白的磷酸化,尤其是SRSF5的250位 serine

CLK1-KD細胞和CLK1-OE細胞的RNA-seq結果分析發現CLK1參與調控細胞循環。針對CLK1的磷酸化蛋白組鑒定出了39個上調,62個下調。GO分析發現CLK1主要參與mRNA可變剪接相關蛋白的磷酸化,尤其是SR蛋白家族。在這些磷酸化水平下調的蛋白中,SRSF5在ser-250位置上磷酸化的SRSFZ顯著。CLK1-KD細胞中WB檢測SR基因家族蛋白表達情況。結果發現只有ser-250位置磷酸化的SRSF5水平降低,其他SR家族成員包括SRSF1、SRSF3和SRSF6都不變化,并且SRSF5-ser-250的表達水平與CLK1表達水平一致—CLK1表達水平下降,SRSF5表達下降,CLK1表達增高,SRSF5表達也增高。構建SRSF5-ser-250 WT和MU載體并轉化入Panc1細胞中,發現SRSF5-ser-250 WT樣本磷酸化水平增加,突變體無變化,并且這種磷酸化水平增加的情況下加入了TG003這種CLK1磷酸化抑制劑時磷酸化情況抵消了。但是在Bxpc-3細胞中未出現這種情況。進一步用Co-IP實驗證實了CLK1和SRSF5在PANC-1和BxPC-3細胞內的互作。內生Co-IP實驗也證實了CLK1和SRSF5的互作。在PANC-1和BxPC-3細胞中進行IF實驗,發現CLK1和SRSF5共定位在核內。在組織中進行IHC實驗發現腫瘤組織中CLK1高表達樣本也伴隨著高SRSF5磷酸化水平。臨床樣本的WB實驗也證實了CLK1和磷酸化SRSF5表達水平一致。

病人在有CLK1高表達、SRSF5高表達時,預后效果很差。當CLK1表達下降,不論SRSF5表達高或者低,病人預后效果相差無幾。而當SRSF5在核內表達降低,不論CLK1表達高或者低,病人預后效果也是相差無幾。這些結果表明臨床上胰腺癌預后效果判斷需要結合CLK1與SRSF5共同判斷。生存率統計上CLK1和SRSF5共同高表達時生存率Z低,CLK1和SRSF5表達都低時生存率Z高。
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圖:CLK1在人胰腺癌細胞中磷酸化SRSF5上250位置上的絲氨酸

3、SRSF5控制胰腺癌細胞中METTL14和Cyclin L2的外顯子跳躍

慢病毒介導構建SRSF5不同異構體的過表達:SRSF5在250位絲氨酸位點突變(S250 MU)、SRSF5在250位絲氨酸磷酸化(S250P)以及野生型SRSF5 (S250 WT)。將這些不同異構體在PANC-1細胞中過表達。菌落形成、轉移實驗以及CCK8分化和細胞計數分析都表明SRSF5250W促進細胞分化和遷移而不是SRSF5250m,這種促分化和遷移事件會因為添加抑制劑TG003而逆轉。但是這種結果在BxPC-3細胞中并沒有出現,反而是SRSF5-S250P促分化和轉移。為了驗證這種差異是否是由于CLK1表達差異造成,作者進一步檢驗在CLK1存在或者缺失的情況下SRSF5的功能發現在PANC-1細胞中CLK1表達沉默會影響SRSF5-WT的促分化功能,但是SRSF5-250P在CLK1表達沉默時仍然會促分化。就算是用抑制劑TG003處理,SRSF5-250P過表達后仍然會促進細胞分化和遷移。在PANC-1和BxPC-3細胞中,磷酸化的SRSF5可能會促使CLK1調控EMT途徑和細胞循環,SRSF5-250P過表達會改變E-鈣黏素、波形蛋白、p53以及p21的表達。在裸鼠中也得到類似的結果。

在兩組PC細胞(A組:慢病毒介導的對照組和CLK1過表達組;B組:SRSF5-WT或SRSF5-MU穩定表達組)中進行RNA-seq,功能富集分析發現在兩組中都存在METTL14 exon 10和Cyclin L2 exon6.3跳躍。RIP-qPCR證實SRSF5與METTL14和Cyclin L2互作,CLIP-qPCR進一步證實SRSF5結合METTL14的exon 10和Cyclin L2的exon 6.2。RNA pull down結果也表明METTL14和Cyclin L2與SRSF5強結合。在細胞PANC-1和BxPC-3細胞中,CLK1敲低促進Cyclin L2 exon 6.3外顯子跳躍但是抑制METTL14的exon 10外顯子跳躍,CLK1過表達得到相反的結果。在BxPC-3細胞中穩定沉默SRSF5并過表達SRSF5-WT或者SRSF5-S250Mu,結果發現只有在SRSF5-WT中CLK1能調控METTL14和Cyclin L2的外顯子跳躍。

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圖:SRSF5控制METTL14和Cyclin L2的外顯子跳躍

4、SRSF5提高m6A水平并且通過抑制METTL14的外顯子跳躍來促進細胞分化和遷移

因為METTL14主要涉及調控m6A,作者好奇METTL14的可變剪接是否影響m6A水平。在PANC-1中過表達SRSF5-WT和SRSF5-P都顯著性增強m6A水平。慢病毒介導METTL14-L和METTL14-S發現METTL14-L相對于其他組m6A水平降低,并且METTL14-L組表現出強的細胞分化和遷移能力。另外SRSF5-WT過表達或者CLK1過表達都能做增加m6A水平和惡性激活行為包括細胞分化、群落形成和遷移以及侵襲,但是這種情況通過沉默METTL14-L可以完全或者部分反轉。在PANC-1細胞中通過SRSF5沉默或者CLK1沉默抑或添加抑制劑TG003導致的這些惡性行為的損傷會因為METTL14-L而不是METTL14-S的異常表達而逆轉。SRSF5通過促進Cyclin外顯子跳躍來促進腫瘤分化,而異常的METTL14和Cyclin L2的外顯子跳躍有益于PDAC的臨床預后。

5、提出CLK1-SRSF5軸誘導m6A甲基轉移酶metl14和Cyclin L2異常外顯子跳躍通過調節細胞周期進展、細胞增殖和轉移而促進胰腺癌發生的過程工作模型

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圖:CLK1調控模型


RIP/CLIP作為研究RNA結合蛋白與RNA互作的技術,在醫學研究中廣為應用。愛基百客生物擁有豐富的RIP、CLIP技術應用經驗,為您的科研之路掃平“障礙”。

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關鍵詞:RIP,CLIP,qPCR

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