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聊聊單細胞實驗哪些事

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聊聊單細胞實驗哪些事

發布日期:2021-07-30 作者: 點擊:


自10x Genomics公司推出chromium單細胞捕獲平臺以來,單細胞技術的應用突飛猛進。各國的科研人員都體驗到了大批量單細胞捕獲技術的優勢,紛紛投入單細胞天地,體會單細胞技術在科技領域的魅力。

當然了,單細胞技術的應用Z初或者說直到今天,也是在醫學領域應用Z為廣泛。它在醫學的各個領域如免疫學、醫藥應用或者神經學等方方面面發光發熱。農學中的畜牧領域也有較為廣泛的涉獵,如豬、牛、羊等常見或其他不常見的動物都能找到較多的單細胞相關文章的發表,但是在植物領域卻應用較晚且能搜索到的文章較少。植物應用受限的原因在與細胞壁。較厚的細胞壁屏障在植物疾病防御或者是逆境脅迫過程中起到了重要的保護作用,但是這種保護作用在單細胞技術應用上卻成為了攔路虎。值得高興的是,隨著單細胞技術的廣泛應用,大量研究報道表明單細胞轉錄組與單核轉錄組的Z終結果差異不大,這也給植物的單細胞技術應用點亮了明燈。單核轉錄組在植物領域越來越受歡迎,也越來越多植物相關研究者加入了單細胞陣營。在技術應用的同時,對于單細胞技術的質控方面,我們有必要仔細進行講解。

關于單細胞懸液制備的質控,相信所有的老師都清楚明白,我們獲得的懸液中,如果是單細胞懸液,需要細胞活性85%以上,無大于40 μm上的細胞碎片(關于碎片這塊,我們要盡量保證碎片盡可能的少,因為雖然小于40 μm的碎片不影響單細胞捕獲,但是影響后續的反轉錄建庫),如果是單核懸液,我們需要保證細胞核的完整性,并且活細胞率要小于5%,同時也需要保證無大于40 μm以上的細胞碎片。

細胞(核)懸液進行10xGenomics的chromium平臺的單細胞捕獲實驗后,后續的質控就是捕獲實驗完成后,油包水的乳濁液是否分層、破油是否充分以及cDNA的濃度和片段分布是否合理。

以上實驗的順利進行后,就到了分析步驟了(什么,建庫、測序質控,哎呀啦,這寫步驟不屬于單細胞實驗特有,其他只有涉及二代建庫測序項目,都需要滿足的條件,我們就不在此說明啦)。

說到上機測序,有一點需要強調的就是,10x單細胞文庫與我們常見的文庫不太一樣,測序策略需要有所調整,進行測序前,我們需要與測序公司仔細溝通,提前說明測序的文庫是單細胞文庫,并且是哪種單細胞文庫類型,這樣就不會出現測序數據不能用的情況啦。

好啦,回到測序后分析的質控話題上來。10x單細胞數據分析的質控,我們常常會經過cellranger后,得到一個網頁版的質控文件,上一個頁面也大家看看吧,相信大家應該都看的比較多了。


11.png

看到這樣的圖形界面,我們要怎么來判斷結果的好壞呢?

首先,預期的捕獲數目與我們的實際捕獲數目是否有出入(Estimated Number of Cells)。

然后就來看看數據的測序量Mean Reads per Cell,它反應了單個細胞的測序量。我們知道,10x官方推薦每個細胞的測序量至少要達到20 K reads/cell,如果達不到,表明測序量不夠。

另外一個質控點就是Median Genes per Cell,基因的中位數,這個數目能反應細胞的整體捕獲基因情況,10x官方認為該質控上數目大于200即可,但是對于大多數樣本來說,需要至少大于500才行,當然,也有一些特殊樣本有很多低表達的細胞,這種情況的話,需要針對后續的分群結果圖來看屬于低表達的細胞類型是哪些,翻閱文獻來判斷這些細胞類型是否真實等。

還有一個質控點就是Fraction Reads in cells,一般如果樣本中游離的mRNA較多,該數值就會較低,常規大約70%即可,如果達不到,我們需要看看樣本制備時的樣本情況了。

除了這些質控點需要關注外,我們看到還有很多其他的質控,一般來說,我們關注以上質控點就行,其他的點出現報錯的幾率較小。

當然了,除了以上文字質控外,我們還有一個圖形質控Barcode Rank Plot。在這里,好的質控結果中,cells和background能夠較好的區分,并且出現明顯的拐點。拐點的數目以及對應的橫坐標數都有要求,見下圖:


11.png

較好的結果就像上圖所示,cells上出現一個明顯的拐點,background出現一個明顯的拐點。

也有cells上出現兩個或以上拐點數的結果,此時就需要針對具體情況具體分析啦。

11.png

中間拐點處一般有一些低表達的細胞或者處于凋亡的細胞或者是雜質等,需要根據具體情況具體分析,如在分群分析時,UMI counts數低的細胞類型是否是正常的細胞類型、是否有凋亡相關基因表達、是否有線粒體基因表達等等。

11.png

像這樣類型的圖,那不必看了,實驗確定失敗,就自行重新實驗吧。

說了,這么多,不知道大家對于10x單細胞實驗質控有沒有了解清楚呢?

愛基百客生物擁有廣泛的醫學、農學相關單細胞實驗經驗,有需要10x單細胞技術服務的老師,可以與我們聯系。當然了,也歡迎各位老師與我們進行10x技術討論,無論哪種需求,能促進單細胞技術的發展,是我們一致的目標,在達到這個目標的道路上,我們都在不懈努力中。


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本文網址:http://www.oyuncash.com/news/603.html

關鍵詞:10x,10xGenomics,單細胞實驗

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