ChIP話題|ChIP之IP實驗詳解

ChIP-seq/qPCR實驗我們經常在文章里看到，作為表觀技術的中流砥柱，ChIP也深得表觀研究者的心，這么重要的實驗，相信很多老師都會進行嘗試，但是大部分老師對于新的實驗技術都是借鑒參考文獻的步驟，這里呢，愛基百客生物擁有了5000+的實驗經驗，給大家分享下ChIP中的注意要點。

ChIP實驗中，IP是非常重要并且有一定技術含量的步驟，在這步驟中，涉及到一些關鍵點我們來一一解說。

我們經?？吹轿恼吕镉衖nput出現，那么input是什么，用來做什么的呢？這里，我們來詳細聊聊它吧。Input實際上就是我們要IP前的溶液中取部分出來進行純化和建庫，取出來的溶液我們稱為input，它本質上就是一個常規的DNA文庫，與我們的重測序文庫類似，但是后續分析時作用不同。在整個ChIP實驗過程中，input在IP-WB和后續ChIP-qPCR中，作為陽性對照；在ChIP實驗的后續生信分析過程中，是作為背景的，分析流程中，我們需要將IP建庫得到的reads去除該位點上input的reads影響，后續我們也會進行詳解，這里就不多說了。說到ChIP-qPCR，我們要重點強調一點，ChIP-qPCR中，大家會關注%input，這時候就需要詳細記錄好input取樣時占總體容積的比例了，比如1000 ml中取20 μl作為input，那么計算%input時IDF（Input?Dilution?Factor）就是50。

IP就不用解釋了吧，就是我們用目的蛋白對應的抗體進行抗體-抗原免疫反應，Z后將目的蛋白互作的DNA富集后純化建庫，也就是整個ChIP實驗中的核心-免疫共沉淀實驗了。

IgG用來干什么呢？IgG通常作為我們目的蛋白的陰性對照來進行實驗的（此處強調一波：IgG是一抗，大家不要搞混了），理論上IgG是不能特異性富集任何的DNA片段。所以如果我們后續需要做seq的話，是不建議做IgG，因為后期建庫一定會失敗（不要問我為什么，不然IgG知道了肯定要跳出來說一句：沒有DNA，拿什么建庫呢），那么是都不用做么？這個也不是，在ChIP-qPCR中，關鍵點是需要計算出樣本的富集倍率，這個時候就是IgG發揮作用的時候了，我們需要將IP產物的CT值來相對陰性組IgG的CT值來計算富集倍率，上一波ChIP-qPCR的計算公式吧：

ΔCt?[normalized?ChIP]?=?(Ct?[ChIP]?-?(Ct?[Input]?-Log2?(Input?Dilution?Factor)))

%?Input?=?2?(-ΔCt?[normalized?ChIP])?

ΔΔCt?[ChIP/NIS]?=?ΔCt?[normalized?ChIP]?-?ΔCt[normalized?NIS/mock]

Fold Enrichment?=?2?(-ΔΔCt?[ChIP/NIS])?

圖：IP-WB結果展示

我們一直跟客戶強調ChIP實驗中，一定要首選ChIP級別抗體。為什么呢？其他級別抗體不可以么？要解答這個問題，我們要先了解下抗體說明書上抗體級別評判問題。我們去抗體公司的官網上進行查看，我們會發現，不同的抗體應用范圍不一樣，就算是名稱一樣的抗體，也有應用類型的差別。如有的抗體只寫了WB，有的寫了WB、IHH、IF等，只有極少數的抗體應用類型上寫到了ChIP。這些應用類型不是說寫了WB就不能做其他實驗，而是代表抗體公司沒有測試或者測試失敗。對于沒有測試的抗體，如只有WB級別的抗體，而老師堅持要用在ChIP實驗上，也是可以的，但是我們要知道，這是需要承擔試錯的風險，因為這個抗體不一定能在ChIP實驗中成功，并且失敗的可能性比較大。而那些寫了應用類型有ChIP的抗體（即所謂的ChIP級別抗體），首先能夠保證在它已經試驗的樣本中，ChIP結果能夠復現（當然也不是說能夠適用所有樣本，但是畢竟風險要小一些）。所以我們回頭來回答開頭的問題了，為什么要盡量選擇ChIP級別抗體，當然是ChIP級別抗體風險更小一些啊，如果是經費充足，愿意試錯，那也是ok的呀，這也是為后人做出貢獻不是。

在進行了一抗孵育之后，我們需要用一定的辦法將一抗富集到的目的蛋白進行拉取，進而獲得互作DNA。常用的辦法就是用磁珠了。在磁珠的選擇上，有protein A、protein G或者是Protein A/G的磁珠，選擇哪種磁珠更合適呢？我們來看看下表吧：

圖：IP-WB結果展示

除了以上介紹的外，還有如IP實驗的buffer（pH、濃度等）、洗脫溫度、時間等都對Z終結果有影響。所以，ChIP實驗需要有大量的經驗才能保證成功。自己實驗的話，一定要提前嘗試多種條件進行優化哦。

好了，介紹了這么多，大家有沒有對ChIP的IP過程有了深入了解呢？愛基百客生物的ChIP實驗，好評不是吹的，文章數量是靠客戶堆的。

話不多說，ChIP實驗有困難，找愛基。愛基百客致力于研究各種疑難樣本的表觀技術研發，竭盡微薄力量為表觀技術添磚加瓦。