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ChIP話題|ChIP之IP實驗詳解

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ChIP話題|ChIP之IP實驗詳解

發布日期:2021-08-10 作者:程偉 點擊:

ChIP-seq/qPCR實驗我們經常在文章里看到,作為表觀技術的中流砥柱,ChIP也深得表觀研究者的心,這么重要的實驗,相信很多老師都會進行嘗試,但是大部分老師對于新的實驗技術都是借鑒參考文獻的步驟,這里呢,愛基百客生物擁有了5000+的實驗經驗,給大家分享下ChIP中的注意要點。


ChIP實驗中,IP非常重要并且有一定技術含量的步驟,在這步驟中,涉及到一些關鍵點我們來一一解說。

圖形2.jpg

01
input、IP、IgG

我們經??吹轿恼吕镉衖nput出現,那么input是什么,用來做什么的呢?這里,我們來詳細聊聊它吧。Input實際上就是我們要IP的溶液中取部分出來進行純化和建庫,取出來的溶液我們稱為input,它本質上就是一個常規的DNA文庫,我們的重測序文庫類似,但是后續分析時作用不同。在整個ChIP實驗過程中,input在IP-WB后續ChIP-qPCR中,作為陽性對照;在ChIP實驗的后續生信分析過程中,是作為背景的,分析流程中,我們需要將IP建庫得到的reads去除該位點上input的reads影響,后續我們也會進行詳解,這里就不多說了。到ChIP-qPCR,我們要重點強調一點,ChIP-qPCR中,大家會關注%input,這時候需要詳細記錄好input取樣時總體容積的比例了,比如1000 ml中取20 μl作為input,那么計算%inputIDFInput?Dilution?Factor)就是50。


IP就不用解釋了吧,就是我們用目的蛋白對應的抗體進行抗體-抗原免疫反應,Z后將目的蛋白互作的DNA富集后純化建庫,也就是整個ChIP實驗中的核心-免疫共沉淀實驗了。


IgG用來干什么呢?IgG通常作為我們目的蛋白的陰性對照來進行實驗的(此處強調一波:IgG是一抗,大家不要搞混了,理論上IgG是不能特異性富集任何的DNA片段。所以如果我們后續需要做seq的話,是不建議做IgG,因為后期建庫一定會失敗不要問我為什么,不然IgG知道了肯定要跳出來說一句:沒有DNA,拿什么建庫呢),那么是都不用做么?這個也不是,在ChIP-qPCR中,關鍵點是需要計算出樣本的富集倍率,這個時候就是IgG發揮作用的時候了,我們需要將IP產物的CT值來相對陰性組IgG的CT值來計算富集倍率,上一波ChIP-qPCR的計算公式吧:

ΔCt?[normalized?ChIP]?=?(Ct?[ChIP]?-?(Ct?[Input]?-Log2?(Input?Dilution?Factor)))

%?Input?=?2?(-ΔCt?[normalized?ChIP])?

ΔΔCt?[ChIP/NIS]?=?ΔCt?[normalized?ChIP]?-?ΔCt[normalized?NIS/mock]

Fold Enrichment?=?2?(-ΔΔCt?[ChIP/NIS])?

00.png

圖:IP-WB結果展示


02
實驗抗體選擇

我們一直跟客戶強調ChIP實驗中,一定要首選ChIP級別抗體。為什么呢?其他級別抗體不可以么?解答這個問題,我們先了解下抗體說明書上抗體級別評判問題。我們抗體公司的官網上進行查看,我們會發現,不同的抗體應用范圍不一樣,就算是名稱一樣的抗體,也有應用類型的差別。如有的抗體只寫了WB,有的寫了WB、IHH、IF等,只有極少數的抗體應用類型上寫到了ChIP。這些應用類型不是說寫了WB就不能做其他實驗,而是代表抗體公司沒有測試或者測試失敗。對于沒有測試的抗體,只有WB級別的抗體,而老師堅持要用在ChIP實驗上,也是可以的,但是我們要知道,這是需要承擔試錯的風險,因為這個抗體不一定能在ChIP實驗中成功,并且失敗的可能性比較大。而那些寫了應用類型有ChIP的抗體(所謂的ChIP級別抗體),首先能夠保證在它已經試驗的樣本中,ChIP結果能夠復現(當然也不是說能夠適用所有樣本,但是畢竟風險要小一些)。所以我們回頭來回答開頭的問題了,為什么要盡量選擇ChIP級別抗體,當然是ChIP級別抗體風險更小一些啊,如果是經費充足,愿意試錯,那也是ok的呀,這也是為后人做出貢獻不是。


03
磁珠選擇

進行了一抗孵育之后,我們需要一定的辦法將一抗富集到的目的蛋白進行拉取,進而獲得互作DNA。常用的辦法就是用磁珠了。在磁珠的選擇上,有protein A、protein G或者是Protein A/G的磁珠,選擇哪種磁珠更合適呢?我們看看下表吧:

00.png:IP-WB結果展示

04
其他注意事項

除了以上介紹的外,還有如IP實驗的buffer(pH、濃度等)、洗脫溫度、時間等都對Z終結果有影響。所以,ChIP實驗需要大量的經驗才能保證成功。自己實驗的話,一定要提前嘗試多種條件進行優化哦。


了,介紹了這么多,大家有沒有對ChIP的IP過程有了深入了解呢?愛基百客生物的ChIP實驗,好評不是的,文章數量靠客戶堆的。


話不多說,ChIP實驗有困難,愛基。愛基百客致力于研究各種疑難樣本的表觀技術研發,竭盡微薄力量為表觀技術添磚加瓦。



END


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本文網址:http://www.oyuncash.com/news/604.html

關鍵詞:ChIP,IP,免疫共沉淀

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