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單細胞話題|scCUT&tag詳解

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單細胞話題|scCUT&tag詳解

發布日期:2021-08-24 作者:程偉 點擊:

2021年1月,Nature Biotechnology雜志同期發布了兩篇關于scCUT&Tag技術應用的文章,揭開了單細胞表觀調控的新篇章。應用較多的scRNA-seq在組織異質性探究上起到了十分重要的作用;scATAC-seq技術的應用是探索單個細胞轉錄調控的關鍵,單個細胞的開放染色質區域捕獲使得轉錄因子在單個細胞的作用被進一步揭示;scCUT&Tag技術能更深層次的探究轉錄因子或者組蛋白修飾在單細胞層面的轉錄調控。這種單細胞層面的表觀多組學研究使得我們探索單細胞世界的步伐更向前邁進了一步。今我們主要介紹一下scCUT&Tag技術,之后,我們會慢慢大家詳解scCUT&tag的技術應用。

1、實驗簡介

CUT-Tag是蛋白質-DNA互作關系研究的新方法,是通過針對靶蛋白(如轉錄因子、染色質重塑蛋白)的抗體和Protein A的介導,使得與Protein A融合的Tn5酶(Tagmentase)在切割DNA片段的同時在序列兩端加上測序接頭,經PCR擴增后形成可以直接用于高通量測序的文庫。隨后文庫進行測序分析,探究目的蛋白結合的DNA片段。單細胞CUT&Tag實驗在bulk CUT&tag基礎上加入了10x單細胞捕獲,每個細胞標記上特定的barcode,實現單細胞分辨率的蛋白-DNA互作關系研究。


2、實驗原理

對細胞進行膜滲透性處理,隨后利用抗體捕獲目的蛋白,并通過二抗放大信號。將ProteinA連接Tn5轉座酶,Tn5轉座酶經過改造,添加測序接頭。利用Protein A識別并結合抗體和二抗,在Mg2+作用下,激活轉座反應,將目的蛋白結合DNA片段進行切割,并添加測序接頭。隨后經過10x上機進行單細胞捕獲,將每個細胞的酶切DNA片段加上特定的barcode進行標記,后續加捕獲的DNA進行PCR擴增,測序、生信分析探究目的蛋白和DNA相互關系。


3、實驗流程

圖片1.png

4、分析流程

00.png


5、樣本要求

總量 > 105 目標細胞個數(Z少 10,000 個細胞);

細胞間無粘連(成團率 <5%);

無大于 40um 的細胞碎片或其他顆粒物;

細胞成活率應大于 85%(臺盼藍染色檢測);

樣本基因組完善

抗體需要有ChIP級別


6、測序數據量

測序數據量:200 M reads


7、項目周期

項目周期:60個工作日


參考文獻

QQ截圖20210824140225.png

Single-cell CUT&Tag analysis of chromatin modifications in differentiation and tumor progression
單細胞CUT&Tag分析不同分化和腫瘤進程中的染色質修飾


研究背景

單細胞基因表達和單細胞開放區域捕獲實驗條件已經十分成熟,但是單細胞層面特異組蛋白修飾的染色質區域捕獲技術仍然是挑戰。本文采用scCUT&Tag技術研究不同的組織中組蛋白修飾情況。本文主要使用H3K27me3抗體標記人胚胎干細胞中PcG沉默區域并對這些區域進行單細胞捕獲和文庫構建。結果表明H3K27me3的scCUT&Tag圖譜可以區分人血液中的細胞類型,并可以從異質性組織中生成細胞類型特異性的PcG圖譜。此外,作者使用scCUT&Tag對一名腦腫瘤患者治療前后的H3K27me3進行了分析,鑒定了腫瘤微環境中的細胞類型以及治療前后樣本中PcG活性的異質性。

00.png

scCUT&Tag(H3K27me3)結果圖


微信圖片_20210824140456.jpg

END


微信公眾號二維碼圖2.jpg



本文網址:http://www.oyuncash.com/news/606.html

關鍵詞:單細胞CUT&TAG,CUT&tag,單細胞

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