新型冠狀病毒的單細胞多組學研究scRNA-seq+scATAC-seq

自2019年新冠病毒肆略以來，眾多科學家們從各種不同的技術及科研角度來研究新冠病毒，雖然新冠疫苗已經成熟并且大多數人也已經接種，但是新冠病毒不斷的變異，它對人類的影響還在持續，附在人類頭頂的陰影也仍然不能去除。

單細胞技術的發展在新冠病毒的研究中起到了十分重要的作用。Z初新冠病毒大爆發時，是單細胞轉錄組的實驗研究給了科研工作者知道，讓我們了解到ACE2這個蛋白在新冠病毒感染中的起重要作用。

目前，高通量單細胞實驗不同組學方案不斷優化及革新。通過單細胞多組學來研究新冠病毒的調控機制，為我們對抗新冠病毒能給予更新的思路。

本文分享了文獻Single-cell multiomic profiling of human lungs reveals cell-type-specific and agedynamic control of SARS-CoV2 host genes，本文對感染新冠病毒的樣本進行scRNA-seq+scATAC-seq的單細胞多組學研究，讓我們來看看新冠病毒在新技術中的應用情況吧。

新冠病毒感染的宿主蛋白已經報道了較多，Z經典的要屬ACE2啦，除此之前，還有TMPRSS2和CTSL這兩個裂解病毒刺突蛋白從而促使病毒進入宿主。而BSG是另一個可以結合病毒刺突蛋白的受體，同時FURIN編碼蛋白酶靶向新冠病毒。本文也重點關注這五個蛋白的基因來看看他們在人類肺部中的表觀調控表現。

1、 單細胞分群結果

選取3個不同年齡段的組織樣品進行單細胞實驗：30周胎齡（30WK^GA）、3周歲（3yo）和30周歲（30yo）。snRNA-seq共捕獲到46500個細胞核，snATAC-seq共捕獲了90980個細胞核。對兩組單細胞數據分別進行分群，發現兩組表觀多組學數據都分到了19個細胞群，分別是epithelial cell(AT1-alveolar type 1, AT2-alveolar type 2, club, ciliated, basal和pulmonary neuroendocrine), mesenchymal cell(myofibroblast, pericyte, matrix fibroblast 1和matrix fibroblast 2), endothelial cell(arterial, lymphatic, capillary 1 and capillary 2)以及hematopoietic cell types (macrophage, B-cell, T-cell, NK cell和enucleated erythrocyte)，具體情況見下圖：

圖：人肺部組織snRNA-seq以及snATAC-seq的分群結果及細胞注釋marker基因情況

2、 與SARS-CoV-2進入宿主細胞時關鍵基因的特異性細胞表達及調控

作者重點關注ACE2、TMPRSS2、CTSL、BSG和FURIN在兩組單細胞表觀多組學數據中的表達情況以及遠端調控模式。結果顯示大部分TMRRSS2表達的細胞在上皮細胞（包含AT1、AT2以及棒狀、纖毛狀和杯狀細胞的氣道細胞），CTSL、BSG和FURIN在AT1、AT2、基質成纖維細胞1,2和M1巨噬細胞。對于染色質開放性研究，ACE2和TMPRSS2在AT1、AT2和氣道細胞如棒狀，纖毛，和基底細胞。相反，CTSL基因體顯示染色質可跨上皮細胞、間充質細胞、內皮細胞和巨噬細胞，BSG和FURIN也顯示出廣泛的染色質可及模式，在內皮細胞(如毛細血管)中活性Z高。這表明氣道和肺泡上皮細胞都表達對SARS-CoV-2進入至關重要的基因。細胞類型特異性表達譜主要由遠端CREs(如增強子)建立。作者在肺部組織中鑒定出了398385個cCREs，其中，與ACE2啟動子區關聯的co-accessible位點有15個，與TMPRSS2啟動子關聯的位點有73個，與CTSL關聯的有73個，與FURIN關聯的有213個，與BSG關聯的有64個。詳情見下圖：

3、AT2細胞中與TMPRSS2相關的遠端調控元件CREs與年齡調控相關

AT2細胞是一種豐富的上皮細胞類型，位于COVID-19擾亂呼吸的肺泡區。因此，我們專注于AT2細胞來評估不同供體年齡組的病毒進入基因動態。作者觀察到成人肺中表達ACE2和TMPRSS2的AT2細胞比例高于兒童樣本，顯著性分析發現ACE2與TMPRSS2的表達情況在不同的年齡段有顯著差異，而BSG、CTSL和FURIN則沒有顯著差異。

對AT2細胞中的cCREs與年齡相關的特性分析。因為ACE2相關細胞數量較少，且TMPRSS2對冠狀病毒進入宿主細胞至關重要，作者主要關注TMPRSS2細胞。作者在scATAC-seq結果的AT2細胞中鑒定到了22745個與年齡相關的位點，這些位點可以分成5個部分cI~cV。與TMPRSS2相關的位點主要集中在30yo組的CIII和3yo及30yo組的cIV。這些位點主要集中在病毒感染、免疫應答和損傷修復(如病毒從宿主細胞釋放)、干擾素- γ介導的信號通路和ERBB信號通路的正調控等過程。對獲得的motif分析發現這些motif對應的轉錄因子控制細胞的命運。另外，控制AT2細胞的免疫調控中，也有一些轉錄因子涉及（STAT、IRF和FOS/JUN）。

采用無監督的方式分析發現9個TMPRSS2 co-accessible相關的年齡相關位點，從之前AT2中分析的73個co-accessible位點分析與年齡的相關想，發現有其他10個位點與年齡相關。在總共的19個TMPRSS2 co-accessible-年齡相關位點中，17個具有統計學意義。而TMPRSS2啟動子區域的開放性狀態在3個不同的年齡段沒有差異，說明TMPRSS2的差異是由遠端調控模式引起的。

4、與呼吸表型和TMPRSS2表達有關的TMPRSS2連鎖cCREs遺傳變異預測

通過定位與TMPRSS2連接的遠端cCREs，作者接下來可以識別非編碼序列變異，這些變異可能影響順式調節活性，并有助于TMPRSS2表達的個體間差異和肺病風險。因此，作者描述了19個cCREs的遺傳變異，這些cCREs的染色質可及性隨年齡增長而增加，并與AT2s中的TMPRSS2相關聯。

基因組突變頻率數據庫gnomAD v3 database下載的2270例單體序列變異數據與AT2中TMPRSS2 age-increasing cCREs關聯分析。將前面鑒定到的轉錄因子如CEBP、ETS、NKK、FOXA、IRF和STAT與變異數據進行關聯分析，Z后鑒定到1100個變異體，其中50個是常見變異，而10個與AT2中的開放性相關。

之后用UK Biobank（UKBB）與AT2開放性相關的10個變異體進行GWAS分析，以期檢驗這些突變體是否與呼吸功能、感染、用藥或其他性狀相關的表型相關。結果表明rs35074065突變體與肺氣腫Z相關，這一突變體也有證據說與哮喘相關。剩下的9個變異中大多數在名義上至少有一種與呼吸功能或呼吸藥物使用相關的表型，包括支氣管擴張，細菌性肺炎、COPD、哮喘和用于治療哮喘的藥物如serevent。

將GTEx v8 release中的eQTL數據與10個突變體進行關聯分析，結果發現與TMPRSS2表達的eQTL相關的突變體有rs35074065、rs1557372和rs9974995。其中rs35074065與TMPRSS2表達有非常直接的關聯。ScRNA-seq數據探尋rs35074065相關的細胞類型發現，AT2細胞和巨噬細胞Z關聯。

5、精細定位COVID-19呼吸衰竭的風險變異3p21.31位點在肺單細胞數據中特異性染色質位點分析

在SARS-CoV-2的研究中，感染呼吸衰竭風險的位點3p21.31位于非編碼區域。作者將這一位點進行關聯分析。位點3p21.31有22個候選突變，其中一個位點rs17713054與AT2中的cCRE相關聯，而rs76374459與紅細胞cCRE關聯。rs17713054位點預測可以結合轉錄因子CEBPA和CEBPB的motif，同時分析ENCODE計劃中CEBPB的ChIP-seq數據發現該位點與CEBPB的peak區域有重疊。而rs76374459與SP11的ChIP-seq數據有重疊。3p21.31信號的候選因果變異也顯示了與呼吸表型的名義關聯的證據，例如支氣管擴張藥物、肺氣腫和慢性支氣管炎等。rs17713054通過scATAC數據關聯scRNA數據探尋到關聯基因SLC6A20, LIMD1, SACM1L和CCRL2，其中SLC6A20主要存在于AT2細胞。eQTL關聯分析發現rs17713054與SLC6A20基因表達關聯度小，但是觀察到與SLC6A20的名義關聯，其中次要等位基因A的表達增加。進一步用eQTL模型分析單細胞數據中rs17713054與SLC6A20基因表達相關性，發現rs17713054與SLC6A20在AT2或者AT1/AT2細胞類型中有強相關性，表明rs17713054可能調控SLC6A20基因表達。