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單細胞轉錄組技術進展與發展

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單細胞轉錄組技術進展與發展

發布日期:2021-12-14 作者: 點擊:

  今天著重介紹一下單細胞轉錄組領域這幾年的幾個重大進步。首先就直接從2015年同一期的兩篇cell開始然后再加上2016年的nature communication。第一篇cell名叫Drop-seq,其過程和原理如圖1所示,首先就是給一個bead表面合成無數含有polyT的反轉錄引物(一個磁珠上含有的polyT引物數量可以高達10的8次方個),然后將每一個磁珠和一個單細胞通過微流控技術放到同一個油包水液滴中進行細胞裂解和逆轉錄,然后回收所有液滴中的cDNA進行PCR建庫、測序及下游分析。


 

微信截圖_20211214111614.png


  介紹完基本的流程之后大家肯定疑惑Drop-seq這個技術是如何區分不同的細胞以及同一細胞中同一基因的不同轉錄本D的呢,答案就在于barcoding技術之中。首先在bead的合成設計中就包含了區分不同細胞和轉錄本的DNA barcode序列(圖2B),不同細胞barcode合成的過程就是每一步分四個反應進行,每個反應只添加一個確定的堿基,當前一步完成進入下一步之前,將所有beads混合后均分為四份,然后分別進入下一輪不同堿基的添加反應。如此經過12個循環之后理論上就可以合成4的12次方(16,777,216)個不同的beads,每個bead所帶有所有cell  barcode都是一致的。然后就是在合成polyT引物之前給所有beads上的引物序列進行八輪堿基添加反應,每一輪隨機添加四種不同的堿基,這樣每一個磁珠上就會有好多(4的8次方=65536)不同的引物,這些引物足以區分同一基因的不同轉錄本。至此,可以大批量做單細胞轉錄組測序的Drop-seq技術橫空出世。

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  同期cell上的另一篇文章也是用的類似的思路,都借助微流控平臺,但是個人覺得更高端,也必然更麻煩,好的是其現在已經商品化了。其好處就是小珠子內部的引物是可以通過UV催化斷裂然后分散到溶液中,更有利于對轉錄本的捕捉,所以對單細胞中的RNA捕捉效率更高(圖3)。其逆轉錄引物的合成過程可就復雜多了,但是邏輯上都要得到區分不同細胞和同一基因不同轉錄本的目的,感興趣的讀者可以自行研讀參考文獻2。


  

微信截圖_20211214111702.png


  第三篇就是去年出來的Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq),整整晚了一年為啥還能出來,因為且可以很好地整合進10XGenomics的平臺(圖4),原理思路和之前類似,話說前兩篇cell


  和10XGenomics搞定長片段序列測序的思路如出一轍,所以10XGenomics必須來一波抓住機會啊。

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本文網址:http://www.oyuncash.com/news/625.html

關鍵詞:單細胞轉錄組,單細胞轉錄組技術

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